Artesis Hogeschool Antwerpen - Industriële Wetenschappen - Kwantitatieve studie van de microbiële dynamica in stressomstandigheden

met

N de celdichtheid van het micro-organisme [CFU/mL]
μmax de maximale specifieke groeisnelheid [1/h]
de actuele omgevingscondities zoals temperatuur, pH, wateractiviteit en concentraties aan nutriënten
de fysiologische toestand van het organisme.

Temperatuur is één van de belangrijkste omgevingsfactoren en voor elk micro-organisme is er een minimumtemperatuur waaronder geen groei meer optreedt, een optimale temperatuur waarbij de groei het snelst is en een maximale temperatuur waarboven geen groei mogelijk is (Madigan et al.2009). Micro-organismen die stress ondergaan door aan hoge temperaturen blootgesteld te worden, kunnen een resistentie ontwikkelen die hen toelaat om verdere tempe-ratuurstress te weerstaan. Dit fysiologisch fenomeen wordt geïnduceerde thermotolerantie of temperatuurstressadaptatie genoemd (Yousef en Courtney 2003).

Temperatuur is één van de belangrijkste omgevingsfactoren en voor elk micro-organisme is er een minimumtemperatuur waaronder geen groei meer optreedt, een optimale temperatuur waarbij de groei het snelst is en een maximale temperatuur waarboven geen groei mogelijk is (Madigan et al. 2009). Micro-organismen die stress ondergaan door aan hoge temperaturen blootgesteld te worden, kunnen een resistentie ontwikkelen die hen toelaat om verdere tempe-ratuurstress te weerstaan. Dit fysiologisch fenomeen wordt geïnduceerde thermotolerantie of temperatuurstressadaptatie genoemd (Yousef en Courtney 2003).

In een studie naar het gedrag van E. coli K12 stelden Van Derlinden et al. (2008, 2009) in sta-tische en dynamische temperatuuromstandigheden een atypische groei vast bij superoptimale temperaturen die mogelijk verklaard wordt door de aanwezigheid van twee subpopulaties, een thermotolerante en een temperatuurgevoelige subpopulatie. Toepassen van een dergelijk he-terogeen populatiemodel geeft een goede beschrijving van het gedrag van E. coli in de onderzochte temperatuuromstandigheden.

Om de invloed van de dynamische temperatuuromstandigheden en bijgevolg het toegepaste temperatuurprofiel op de microbiële groei en inactivatie en op de stressadaptatie te beschrij-ven is echter geen model beschikbaar.Het doel van dit doctoraat is om de geïnduceerde thermotolerantie van Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae in dynamische tempera-tuuromstandigheden te bestuderen en te kwantificeren en dit fenomeen te incorporeren in een algemeen microbieel groeimodel.

In het eerste deel van dit doctoraat wordt het gedrag van E. coli K12 MG1655 onder invloed van temperatuurstress rond Tmax in dynamische temperatuuromstandigheden onderzocht. De experimenten verlopen in gecontroleerde omstandigheden door gebruik van een computerge-stuurde bioreactor. De invloed van de initiële celconcentratie, de grootte van de temperatuur-stijging en de initiële en de finale temperatuur op de microbiële evolutie van E. coli K12 MG1655 wordt onderzocht door aan de bacteriecultuur een temperatuurprofiel op te leggen.

Verscheidene studies in de literatuur richten zich op het effect van stijgende temperaturen en de snelheid van temperatuurstijging op geïnduceerde thermotolerantie en zijn invloed op de inactivatiesnelheid van bacteriën zoals, e.g., Escherichia coli (e.g., Tsuchido et al. 1982 en Valdramidis et al. 2006) en de gist Saccharomyces cerevisiae (Marechal et al. 1999, Martinez de Marañón et al. 1999 en Guyot et al. 2005). Deze auteurs stelden vast dat de thermische resistentie van micro-organismen vermindert met snellere temperatuurstijgingen. Geen van deze onderzoekers evalueert het effect van stressadaptatie op de groeikinetiek. Ook de finale temperatuur, Tf, van het aan de bacteriecellen opgelegde temperatuurprofiel beïnvloedt de stressadaptatie (Mensonides et al. 2007). De initiële celconcentratie, n0, heeft een invloed op het verloop van de microbiële groeicurve, maar ook op de stressadaptatie (Van Derlinden 2009). Gebaseerd op deze kennis worden de beïnvloedende factoren op stressadaptatie kwa-litatief en kwantitatief onderzocht.

In het project wordt op basis van experimentele data en vertrekkend van bestaande modellen een modelstructuur voorgesteld die rekening houdt met de beïnvloedende factoren. Vergelij-ken van de empirische data met verschillende modelsimulaties levert een schatting van de modelparameters. Hierbij wordt met behulp van simulatiesoftware de gemiddelde kwadrati-sche fout (Mean Squared Error) tussen de modelsimulatie en de experimentele data gemini-maliseerd. Modelstructuur samen met modelparameters geeft een volledige beschrijving van het proces.

In een tweede deel van dit onderzoek worden het gedrag van S. cerevisiae rond zijn maximale groeitemperatuur en de invloed van dynamische temperatuurprofielen op de geïnduceerde thermotolerantie van deze gist onderzocht. De transfereerbaarheid van het voor E. coli opge-stelde model naar S. cerevisiae wordt geëvalueerd en eventueel wordt het model aangepast. Om industriële toepassing van de gist na stressadaptatie toe te laten, is een voldoend hoge ethanolproductiviteit noodzakelijk. De ethanolconcentratie na fermentatie met de geadapteer-de gist wordt gemeten.

De toepassingen van dit onderzoek zijn tweeërlei. Enerzijds wordt het beschrijven van het ge-drag van micro-organismen in functie van de omgevingsparameters, zoals temperatuur, toe-gepast in de predictieve microbiologie als hulpmiddel om de evolutie van pathogene en bederforganismen van voedingsmiddelen te voorspellen. Door het modelleren van stressadaptatie kan de microbiële respons op temperatuurveranderingen en bijgevolg het risico op microbiële besmetting van voedsel betrouwbaarder geschat worden. Anderzijds kunnen deze modellen gebruikt worden bij het conditioneren van de productiestam bij bioethanolfermentatie. Voor de productie van bioethanol uit polysachariden zoals zetmeel en cellulose is het meest aangewezen proces de enzymatische hydrolyse van het polysacharide gevolgd door een fermentatieve omzetting van de gevormde suikers naar ethanol. Dit proces wordt preferentieel door gelijktijdige versuikering en fermentatie (SSF, simultaneous saccharification and fermentation) uitgevoerd om osmotische stress en enzyminhibitie te vermijden. De optimale temperatuur voor de enzymreactie (45-50°C) ligt echter hoger dan de maximale groeitemperatuur van de gist (25-35°C). Door een dynamische gecontroleerde temperatuurbehandeling van de gist kan deze optimaal geconditioneerd worden en kan de thermotolerante gistfractie toegepast worden bij ethanolproductie (Edgardo et al. 2008 en Banat et al. 1995).